Das Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die von bestimmten Archaeen und Bakterien verwendet werden, um die Ausbreitung von Viren in ihnen zu hemmen oder "einzuschränken". Sie kommen besonders häufig in Bakterien vor und sind Teil ihres Abwehrsystems gegen fremde DNA, das als Restriktions- / Modifikationssystem bekannt ist..
Diese Enzyme katalysieren die Spaltung von Doppelband-DNA an bestimmten Stellen, reproduzierbar und ohne den Einsatz zusätzlicher Energie. Die meisten erfordern die Anwesenheit von Cofaktoren wie Magnesium oder anderen zweiwertigen Kationen, obwohl einige auch ATP oder S-Adenosylmethionin benötigen.
Restriktionsendonukleasen wurden 1978 von Daniel Nathans, Arber Werner und Hamilton Smith entdeckt, die für ihre Entdeckung den Nobelpreis für Medizin erhielten. Ihr Name leitet sich im Allgemeinen von dem Organismus ab, in dem sie zuerst beobachtet werden.
Solche Enzyme werden häufig bei der Entwicklung von DNA-Klonierungsmethoden und anderen molekularbiologischen und gentechnischen Strategien verwendet. Ihre spezifischen Sequenzerkennungsmerkmale und die Fähigkeit, Sequenzen in der Nähe der Erkennungsstellen zu schneiden, machen sie zu leistungsstarken Werkzeugen für genetische Experimente..
Fragmente, die durch Restriktionsenzyme erzeugt wurden, die auf ein bestimmtes DNA-Molekül eingewirkt haben, können verwendet werden, um eine "Karte" des ursprünglichen Moleküls zu erstellen, indem Informationen über die Stellen verwendet werden, an denen das Enzym DNA geschnitten hat..
Einige Restriktionsenzyme haben möglicherweise die gleiche Erkennungsstelle auf der DNA, aber sie schneiden sie nicht unbedingt auf die gleiche Weise. Somit gibt es Enzyme, die schneiden und stumpfe Enden hinterlassen, und Enzyme, die kohäsive Enden schneiden, die unterschiedliche Anwendungen in der Molekularbiologie haben.
Derzeit gibt es Hunderte verschiedener kommerziell erhältlicher Restriktionsenzyme, die von verschiedenen Handelshäusern angeboten werden. Diese Enzyme fungieren als "benutzerdefinierte" molekulare Scheren für verschiedene Zwecke.
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Restriktionsenzyme erfüllen die entgegengesetzte Funktion von Polymerasen, da sie die Esterbindung innerhalb der Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten Nukleotiden in einer Nukleotidkette hydrolysieren oder aufbrechen..
In der Molekularbiologie und Gentechnik sind sie weit verbreitete Werkzeuge zur Konstruktion von Expressions- und Klonierungsvektoren sowie zur Identifizierung spezifischer Sequenzen. Sie sind auch nützlich für die Konstruktion rekombinanter Genome und haben ein großes biotechnologisches Potenzial..
Jüngste Fortschritte in der Gentherapie verwenden derzeit Restriktionsenzyme zur Einführung bestimmter Gene in Vektoren, die Vehikel für den Transport solcher Gene in lebende Zellen sind und wahrscheinlich die Fähigkeit haben, sich in das zelluläre Genom einzufügen, um dauerhafte Veränderungen durchzuführen.
Restriktionsenzyme können die Doppelband-DNA-Spaltung katalysieren, obwohl einige Einzelband-DNA-Sequenzen und sogar RNA erkennen können. Der Schnitt erfolgt nach der Erkennung der Sequenzen.
Der Wirkungsmechanismus besteht in der Hydrolyse der Phosphodiesterbindung zwischen einer Phosphatgruppe und einer Desoxyribose im Rückgrat jedes DNA-Strangs. Viele der Enzyme können an derselben Stelle schneiden, die sie erkennen, während andere vor oder nach derselben zwischen 5 und 9 Basenpaare schneiden.
Normalerweise schneiden diese Enzyme am 5'-Ende der Phosphatgruppe und führen zu DNA-Fragmenten mit einem 5'-Phosphorylende und einem 3'-terminalen Hydroxylende.
Da Proteine nicht direkt mit der Erkennungsstelle in der DNA in Kontakt kommen, müssen sie nacheinander transloziert werden, bis die spezifische Stelle erreicht ist, möglicherweise durch "Gleitmechanismen" auf dem DNA-Strang..
Während der enzymatischen Spaltung wird die Phosphodiesterbindung jedes der DNA-Stränge innerhalb eines der aktiven Zentren von Restriktionsenzymen positioniert. Wenn das Enzym die Erkennungs- und Spaltstelle verlässt, geschieht dies durch unspezifische vorübergehende Assoziationen.
Derzeit sind fünf Arten von Restriktionsenzymen bekannt. Hier ist eine kurze Beschreibung von jedem:
Diese Enzyme sind große pentamere Proteine mit drei Untereinheiten, eine zur Restriktion, eine zur Methylierung und eine zur Sequenzerkennung in DNA. Diese Endonukleasen sind multifunktionelle Proteine, die Restriktions- und Modifikationsreaktionen katalysieren können, sie haben ATPase-Aktivität und auch DNA-Topoisomerase..
Enzyme dieses Typs waren die ersten Endonukleasen, die entdeckt wurden. Sie wurden erstmals in den 1960er Jahren gereinigt und wurden seitdem eingehend untersucht.
Typ I-Enzyme werden als biotechnologisches Werkzeug nicht häufig verwendet, da die Spaltstelle in einem variablen Abstand von bis zu 1.000 Basenpaaren von der Erkennungsstelle liegen kann, was sie hinsichtlich der experimentellen Reproduzierbarkeit unzuverlässig macht..
Sie sind Enzyme, die aus Homodimeren oder Tetrameren bestehen und DNA an definierten Stellen mit einer Länge zwischen 4 und 8 bp schneiden. Diese Spaltstellen sind typischerweise palindromisch, dh sie erkennen Sequenzen, die in beide Richtungen auf die gleiche Weise gelesen werden..
Viele der Restriktionsenzyme vom Typ II in Bakterien schneiden DNA, wenn sie ihren Fremdcharakter erkennen, da sie nicht die typischen Modifikationen aufweisen, die ihre eigene DNA haben sollte.
Dies sind die einfachsten Restriktionsenzyme, da sie keinen anderen Cofaktor als Magnesium (Mg +) benötigen, um DNA-Sequenzen zu erkennen und zu schneiden..
Die Präzision von Restriktionsenzymen vom Typ II beim Erkennen und Schneiden einfacher Sequenzen in DNA an präzisen Positionen macht sie zu einer der am weitesten verbreiteten und unverzichtbaren in den meisten Bereichen der Molekularbiologie..
Innerhalb der Gruppe der Restriktionsenzyme vom Typ II gibt es mehrere Unterklassen, die nach bestimmten Eigenschaften klassifiziert sind, die für jede einzelne einzigartig sind. Die Klassifizierung dieser Enzyme erfolgt durch Hinzufügen von Buchstaben des Alphabets von A bis Z nach dem Namen des Enzyms.
Einige der für ihre Nützlichkeit bekanntesten Unterklassen sind:
Sie sind Dimere verschiedener Untereinheiten. Sie erkennen asymmetrische Sequenzen und werden als ideale Vorläufer für die Erzeugung von Schneidenzymen verwendet.
Sie bestehen aus einem oder mehreren Dimeren und schneiden DNA auf beiden Seiten der Erkennungssequenz. Schneiden Sie beide DNA-Stränge in einem Basenpaarintervall vor der Erkennungsstelle ab.
Enzyme dieses Typs sind Polypeptide mit Funktionen der Teilung und Modifikation von DNA-Strängen. Diese Enzyme schneiden beide Stränge asymmetrisch.
Die Enzyme dieser Unterklasse werden in der Gentechnik am häufigsten verwendet. Sie haben eine katalytische Stelle und erfordern im Allgemeinen einen allosterischen Effektor. Diese Enzyme müssen mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz interagieren, um eine effiziente Spaltung durchzuführen. Innerhalb dieser Unterklasse befinden sich die Enzyme EcoRII und EcoRI.
Restriktionsendonukleasen vom Typ III bestehen nur aus zwei Untereinheiten, von denen eine für die Erkennung und Modifikation der DNA verantwortlich ist, während die andere für die Sequenzspaltung verantwortlich ist.
Diese Enzyme benötigen für ihre Funktion zwei Cofaktoren: ATP und Magnesium. Restriktionsenzyme dieses Typs besitzen zwei asymmetrische Erkennungsstellen, translozieren DNA in ATP-abhängiger Weise und schneiden sie zwischen 20 und 30 bp neben der Erkennungsstelle..
Typ IV-Enzyme sind leicht zu identifizieren, da sie DNA mit Methylierungsmarkierungen schneiden. Sie bestehen aus mehreren verschiedenen Untereinheiten, die für das Erkennen und Schneiden der DNA-Sequenz verantwortlich sind. Diese Enzyme verwenden GTP und zweiwertiges Magnesium als Cofaktoren.
Spezifische Spaltstellen umfassen Nukleotidstränge mit methylierten oder hydroxymethylierten Cytosinresten auf einem oder beiden Nukleinsäuresträngen..
Diese Klassifizierung gruppiert die Enzyme vom CRISPER-Cas-Typ, die spezifische DNA-Sequenzen von eindringenden Organismen identifizieren und schneiden. Cas-Enzyme verwenden einen synthetisierten Leit-RNA-Strang von CRISPER, um eindringende Organismen zu erkennen und anzugreifen.
Als Typ V klassifizierte Enzyme sind Polypeptide, die durch Enzyme vom Typ I, II und II strukturiert sind. Sie können Abschnitte der DNA von fast jedem Organismus und mit einem weiten Längenbereich schneiden. Ihre Flexibilität und Benutzerfreundlichkeit machen diese Enzyme neben Typ-II-Enzymen zu einem der heute am weitesten verbreiteten Werkzeuge in der Gentechnik..
Restriktionsenzyme wurden zum Nachweis von DNA-Polymorphismen verwendet, insbesondere in populationsgenetischen Studien und Evolutionsstudien unter Verwendung mitochondrialer DNA, um Informationen über die Nukleotidsubstitutionsraten zu erhalten..
Gegenwärtig weisen die zur Transformation von Bakterien für verschiedene Zwecke verwendeten Vektoren Multiklonierungsstellen auf, an denen Erkennungsstellen für mehrere Restriktionsenzyme vorhanden sind..
Unter diesen Enzymen sind die beliebtesten EcoRI, II, III, IV und V, die zum ersten Mal von erhalten und beschrieben wurden E coli;; HindIII, aus H. influenzae und BamHI aus B. amyloliquefaciens.
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