Das Voges-Proskauer-Test ist ein biochemischer Test zur Identifizierung von Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae. Es ist besonders nützlich zur Unterscheidung von Stämmen von Escherichia coli von Klebsiella und Enterobacter, unter anderem.
Der Test wird in einem flüssigen Kulturmedium namens Methyl Red-Voges Proskauer durchgeführt, besser bekannt unter dem Akronym RM / VP. Dieses Medium besteht aus gepuffertem Polypepton, Glucose, Dikaliumphosphat und destilliertem Wasser..
Das derzeitige RM / VP-Medium ist eine Modifikation des Clark- und Lubs-Mediums, das ursprünglich eine geringere Konzentration an Peptonen und Glucose enthielt. Daher wurde weniger Wasserstoffion erzeugt, das für die positive Voges-Proskauer-Reaktion benötigt wird..
Der Test basiert auf der Fähigkeit des Mikroorganismus, Glucose über den Butylen-Glykol-Weg zu verwenden und in Gegenwart von Sauerstoff und einem alkalischen pH-Wert ein neutrales Endprodukt namens Acetoin zu bilden.
Im RM / VP-Medium kann neben dem Voges-Proskauer-Test auch der Methylrot-Test nachgewiesen werden.
Artikelverzeichnis
Die im Medium vorhandenen Pluripeptone liefern die wesentlichen Nährstoffanforderungen für das Bakterienwachstum. Glukose ist ihrerseits die Hauptverbindung. Viele Bakterien haben die Fähigkeit, Glukose zu metabolisieren und Brenztraubensäure zu bilden.
Brenztraubensäure ist ein Mittelpunkt des Glukosestoffwechsels und von dort aus kann jeder Mikroorganismus unterschiedliche Wege gehen. Einige bilden gemischte Säuren wie Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure und Bernsteinsäure, andere bilden neutrale Produkte wie 2,3-Butandiol..
Der Voges-Proskauer-Test zeigt die Fähigkeit des Mikroorganismus, unter aeroben Bedingungen Acetylmethylcarbinol (Acetoin), ein Zwischenprodukt von 2,3-Butandiol, zu bilden.
Acetoin wird reduziert und bildet 2,3-Butandiol, aber diese Reaktion ist reversibel. Wenn also 2,3-Butandiol oxidiert wird, wird Acetoin gebildet. Daher ist Sauerstoff essentiell.
Dikaliumphosphat ist der Puffer, der die Mischung auf einen pH-Wert von 6,9 ± 0,2 puffert.
Um die Reaktion zu demonstrieren, muss eine Entwicklung unter Verwendung von zwei Reagenzien (Barrit-Reagenzien) durchgeführt werden, die als Voges A und Voges B bekannt sind.
Voges A ist eine 5% ige Lösung von α-Naphthol und Voges B ist eine 40% ige Kaliumhydroxidzubereitung. Wenn Kaliumhydroxid nicht verfügbar ist, kann es durch 40% iges Natriumhydroxid ersetzt werden.
Α-Naphthol ist ein Katalysator, der die Farbintensität der Reaktion erhöht und den Test empfindlicher macht. Das α-Naphthol muss immer zuerst zugegeben werden, wobei das Röhrchen geschüttelt wird, damit das Medium mit dem Sauerstoff in Kontakt kommt. Auf diese Weise wird das vorhandene Acetoin zu Diacetyl oxidiert und 2,3-Butandiol wird zu Acetoin oxidiert, wobei dieses zu Diacetyl geleitet wird..
Auf diese Weise bindet α-Naphthol an Diacetyl, das sich wiederum mit dem in der Aminosäure Arginin vorhandenen Guanidinkern verbunden hat, wobei letzterer von Pluripeptonen stammt.
Kalium- oder Natriumhydroxid ist seinerseits für die Absorption von CO verantwortlichzwei und mit Peptonen zu reagieren. Diese Reaktion führt zur Bildung einer lachsrosa Farbe, die nach sehr gutem Schütteln des Röhrchens deutlich sichtbar ist..
Die richtigen Mengen an Diacetyl, Pepton und α-Naphthol müssen gemischt werden, damit die Farbe sofort auftritt. Geschieht dies nicht, darf das Röhrchen vor dem Dolmetschen 15 Minuten ruhen..
Normalerweise ist der Test nach 2 bis 5 Minuten positiv, wenn eine schwache rosa Farbe erkennbar ist. Wenn Sie die Farbe 30 Minuten bis 1 Stunde ruhen lassen, ist die Intensität der Farbe maximal (intensives Rot)..
Ein negativer Test wird angezeigt, wenn die Brühe gelb wird. Wenn der Test nach 1 Stunde negativ ist, kann sich durch die Reaktion von Kaliumhydroxid auf α-Naphthol eine Kupferfarbe bilden.
17 g des dehydrierten Kulturmediums werden gewogen und in einem Liter destilliertem Wasser gelöst. 5 Minuten stehen lassen. Zum Kochen bringen, um sich vollständig aufzulösen. 3 bis 4 ml in Röhrchen servieren und im Autoklaven 15 Minuten bei 121 ° C sterilisieren.
Das dehydrierte Kulturmedium hat eine beige Farbe und das hergestellte Medium eine hell bernsteinfarbene Farbe..
Der endgültige pH-Wert des Mediums beträgt 6,9 ± 0,2.
5 g α-Naphthol werden abgewogen und in 50 ml Ethylalkohol (absolut) gelöst. Fügen Sie dann Ethylalkohol hinzu, bis 100 ml erreicht sind..
40 g Kaliumhydroxid werden gewogen und in 50 ml destilliertem Wasser in einem Becherglas gelöst. Das Glas muss in ein kaltes Wasserbad gestellt werden, um die Temperatur zu kontrollieren, da die Temperatur beim Auflösen der Zubereitung stark ansteigt.
Nachdem die Lösung kalt ist, wird sie in einen Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt..
Zur Durchführung des Voges-Proskauer-Tests wird eine RM / VP-Brühe mit dem untersuchten Mikroorganismus aus einer Reinkultur 18 bis 24 Stunden lang inokuliert..
Das Inokulum sollte nicht sehr dicht sein. Es wird 24 bis 48 Stunden bei 35-37 ° C inkubiert, obwohl manchmal eine Inkubation über mehrere Tage erforderlich ist. Cowan und Steel glauben, dass 5 Tage die minimale Inkubationszeit sind, die erforderlich ist, um alle positiven Voges-Proskauer (VP) -Spezies der Enterobacteriaceae-Familie nachzuweisen..
Trennen Sie ein 1-ml-Aliquot in ein Röhrchen und entwickeln Sie es wie folgt: Geben Sie 12 Tropfen (0,6 ml) Voges A-Reagenz und 4 Tropfen (0,2 ml) Voges B hinzu. Wenn der Test jedoch immer noch negativ ist, lassen Sie ihn sitzen und beobachten Sie das Röhrchen nach 30 Minuten bis 1 Stunde..
Das Auftreten einer rosaroten Farbe zeigt an, dass die Voges-Proskauer-Reaktion positiv ist. Bleibt das Medium gelb, ist die Reaktion negativ.
Das Hinzufügen von Entwicklern in der angegebenen Reihenfolge und Menge ist wichtig, um falsche Negative zu vermeiden..
Der Voges-Proskauer-Test ist nützlich, um zwischen Stämmen von zu unterscheiden E coli das sind VP-negativ, von den Gattungen Klebsiella, Enterobacter, Serratia ua, die VP-positiv sind.
Kontrollstämme können verwendet werden, um die Qualität des hergestellten Mediums zu testen, einschließlich Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium und Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Erwartete Ergebnisse sind positive Voges-Proskauer-Reaktionen nur für K. pneumoniae Y. E. cloacae. Der Rest gibt negative Reaktionen.
Bisher hat noch niemand einen Kommentar zu diesem Artikel abgegeben.