Das Thayer Martin Agar ist ein sehr nahrhaftes und selektives festes Medium zur Isolierung von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae; beide als pathogene oder klinisch wichtige Neisserias bekannt.
Eine der wichtigsten Besonderheiten von Thayer Martin Agar ist der hohe Gehalt an Nahrungsergänzungsmitteln. Diese Eigenschaft ist wichtig, da Neisserias aus ernährungsphysiologischer Sicht sehr anspruchsvolle Mikroorganismen sind und daher nicht in gängigen Medien wachsen..
Da diese Mikroorganismen normalerweise in nicht sterilen Bereichen vorkommen, müssen Inhibitoren hinzugefügt werden, die das Wachstum der begleitenden Flora verhindern, ohne die Entwicklung der Gattung Neisseria zu beeinträchtigen.
Dieser Agar besteht aus GC-Basisagar, Hämoglobin, zusätzlichen Nahrungsergänzungsmitteln und einem Komplex hemmender Substanzen (Antibiotika und Antimykotika). Die Handelshäuser verkaufen jede der Ergänzungen separat.
Die in dieses Medium zu säende Probe hängt von dem gesuchten Mikroorganismus ab. Damit Neisseria Gonorrhoe Ideale Proben sind Vaginal- und Harnröhrensekrete. Während für Meningokokken Die am häufigsten verwendeten Proben sind CSF-, Pharyngeal- und Nasopharyngeal-Exsudate.
Artikelverzeichnis
Neisseren sind Mikroorganismen, die als störend eingestuft werden und daher schwierig zu isolieren sind. Aus diesem Grund ist Thayer Martín ein komplexes Medium und jede seiner Komponenten erfüllt eine Funktion, die im Folgenden erläutert wird:
GC-Agar enthält Proteosepepton, Maisstärke, Natriumchlorid, Dikaliumphosphat, Monokaliumphosphat und Agar-Agar. Seine Komponenten liefern die Grundnährstoffe für die mikrobielle Entwicklung, neutralisieren toxische Fettsäuren, tragen zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts bei, definieren den pH-Wert und verleihen dem Medium eine feste Konsistenz..
Hämoglobin liefert die Faktoren V und X (Nicotinamidadenindinukleotid NAD bzw. Hämin). Aus diesem Grund wachsen auch Haemophilus-Arten in diesem Medium. Hämoglobin kann kommerziell in dehydrierter Form erhalten werden oder frisches defibriniertes Rinderblut kann dem Medium zugesetzt werden..
Andererseits muss dem Thayer-Martin-Medium auch eine Anreicherungsergänzung zugesetzt werden, da die im Basisagar enthaltenen Nährstoffe für die Anforderungen der Gattung Neisseria nicht ausreichen..
Das am häufigsten verwendete Anreicherungspräparat heißt Isovitalex. Es enthält Glutamin, Adenin, NAD, Cocarboxylase, Guanin, Eisennitrat, p-Aminobenzoesäure, Vitamin B12, Thiamin und Glucose. Alle diese Verbindungen sind für die ordnungsgemäße Entwicklung pathogener Neisserien notwendig.
Da es sich um ein sehr nahrhaftes Medium handelt, müssen Inhibitoren verwendet werden, die das Wachstum von Mikroorganismen der üblichen Flora des Gebiets verhindern und somit die Isolierung der Gattung Neisseria begünstigen..
Der Inhibitorkomplex besteht aus Vancomycin, Colistin und Nystatin. Vancomycin hemmt das Wachstum von grampositiven Bakterien, Colistin verhindert das Wachstum von gramnegativen Bakterien wie Pseudomonas und einigen saprophytischen Neisserien, und Nystatin wirkt auf Hefe als Candida albicans.
Thayer Martin Agar wurde jedoch später modifiziert; Die Veränderungen bestanden aus der Zugabe von Trimethoprim, der Erhöhung der Agarmenge und der Zugabe von zusätzlicher Glucose. Diese Veränderungen verbesserten die Erholung der Arten von signifikant Neisseria gonorrhoeae.
Es ist zu beachten, dass Trimethoprim das Wachstum der Gattung Proteus und die daraus resultierende Schwarmbildung hemmt. In diesem Sinne sind Antibiotika diejenigen, die dem Thayer-Martin-Medium den selektiven Charakter verleihen.
8,2 g dehydriertes GC-Medium werden abgewogen und in 100 ml suspendiert. Mischen und 1 Minute unter häufigem Rühren kochen, um sich vollständig aufzulösen. Sterilisieren Sie die Mischung in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 Minuten.
2 g dehydriertes Hämoglobin in 2 oder 3 ml heißem destilliertem Wasser suspendieren, bis eine gleichmäßige Mischung entsteht. Fügen Sie nach und nach mehr Wasser hinzu, um ein Volumen von 100 ml zu erhalten. Die Suspension muss vor dem Sterilisieren homogen sein.
15 Minuten im Autoklaven sterilisieren.
Rekonstituieren Sie die kommerzielle Durchstechflasche mit dem Verdünnungsmittel, das von derselben kommerziellen Firma bereitgestellt wurde. Gut mischen. Die Menge des zu verwendenden Verdünnungsmittels wird in den Kit-Anweisungen angegeben..
Rekonstituieren Sie die Durchstechflasche mit dem vom Handelsunternehmen bereitgestellten Verdünnungsmittel. Gut mischen. Die Menge des zu verwendenden Verdünnungsmittels wird in den Kit-Anweisungen angegeben..
Für jeweils 100 ml GC-Agar gehen Sie wie folgt vor:
Wenn der GC-Agar den Autoklaven verlässt, lassen Sie ihn auf eine Temperatur von ungefähr 50 ° C abkühlen und geben Sie 2 ml der hergestellten Hämoglobinlösung, 2 ml des Anreicherungszusatzes (Isobitalex oder Britalex) und 2 ml des Hemmzusatzes hinzu. Mischen und in sterilen Petrischalen servieren..
Erstarren lassen und bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren.
Die Farbe des vorbereiteten Mediums ist kirschrot. Der endgültige pH-Wert des Mediums beträgt 7,2 ± 0,2
8,2 g dehydriertes GC-Medium werden abgewogen und in 100 ml suspendiert. 1 g Agar-Agar und 0,3 g Glucose zugeben. Mischen und 1 Minute unter häufigem Rühren kochen, um sich vollständig aufzulösen. Sterilisieren Sie die Mischung in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 Minuten.
Bereiten Sie das Hämoglobin und die Anreicherungsergänzung wie oben beschrieben vor.
Das verwendete Inhibitionspräparat ist V. C. N. T. (Vancomycin, Colistin, Nystatin, Trimethoprim)..
Verfahren Sie wie für den ursprünglichen Thayer-Martin-Agar beschrieben.
Thayer Martin Agar sollte sich erwärmen lassen, bevor die Proben gestreift werden. Häufig verwendete Proben sind Rachenabstriche, Nasentupfer, Vaginal-, Harnröhren- und / oder Rektalausfluss sowie Liquor..
Verwenden Sie frische Proben und machen Sie starke Inokula auf dem Agar. Die Proben werden direkt durch Materialaustrag und anschließende Verarmungsstreifen auf der Oberfläche ausgesät.
Die Platten werden 24 bis 48 Stunden bei 35-37ºC in einem mikroaerophilen Gefäß (5% CO) inkubiertzwei). Am Ende der Inkubationszeit werden die Platten auf kleine Kolonien untersucht, die eine graue Farbe und manchmal ein schleimiges Aussehen haben..
Führen Sie Gramm- und bestätigende biochemische Tests an verdächtigen Kolonien durch.
Die folgenden mikrobiellen Stämme können zur Qualitätskontrolle von Thayer Martin Agar verwendet werden.
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 und Meningokokken ATCC 13090; Bei beiden Stämmen wird eine zufriedenstellende Entwicklung erwartet.
Die folgenden Stämme sollten ebenfalls enthalten sein: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 und Candida albicans ATCC 10231. In allen von ihnen wird eine vollständige oder teilweise Hemmung in diesem Medium erwartet..
-Es ist zu beachten, dass Bakterien, die gegen die verwendeten Inhibitoren resistent sind, im Medium wachsen können.
-Es gibt Stämme von Neisseria Gonorrhoe die empfindlich auf die verwendete Vancomycin-Konzentration reagieren kann. Aus diesem Grund wird empfohlen, Schokoladenagar mit Isovitalex, jedoch ohne Inhibitoren, zu verwenden..
-Es gibt Nystatin-resistente Hefestämme, die in diesem Medium wachsen und die Isolierung pathogener Neisserien, insbesondere Gonokokken, stören können..
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