Das Oxidase-Test Es ist eine diagnostische Methode, die das Vorhandensein des Enzymkomplexes Cytochromoxidase c zeigt. Dieses System induziert die Umwandlung von Cytochrom, das zu oxidiertem reduziert ist, da es Sauerstoff einfängt und dieser wiederum als letzter Elektronenakzeptor (H) fungiert+) in der Atmungskette.
Der Begriff Oxidase ist eine Abkürzung für das Enzym Cytochromoxidase, auch bekannt als Indophenoloxidase. In der Antike glaubte man, dass die Enzyme Cytochromoxidase und Indophenoloxidase zwei verschiedene Enzyme waren, aber heute ist bekannt, dass sie gleich sind.
Cytochrome sind Hämoproteine, die Eisen enthalten und das Cytochromoxidase-System vervollständigen. Cytochrome können von Art zu Art variieren.
Es gibt verschiedene Arten von Cytochromen (Cytochrome a1, a2, a3 und 0). Einige Bakterien können nur eine produzieren, andere bis zu zwei oder drei gleichzeitig. In diesem Sinne ist das Vorhandensein von Cytochrom a und a3 als Cytochromoxidase c bekannt. Dies ist die Art von Cytochrom, die der Oxidasetest nachweist..
Die Gattungen Neisseria und Pseudomonas enthalten Cytochromoxidase c. Diese Gattungen ergeben den positiven Oxidasetest und helfen, sie von den Gattungen Acinetobacter bzw. Stenotrophomonas zu unterscheiden..
Es gibt auch andere Gattungen, die Oxidase-positiv sind.
Artikelverzeichnis
Das Cytochromoxidase-C-System funktioniert wie folgt: Oxidase-positive Mikroorganismen verwenden Sauerstoff, um durch aerobe Atmung Energie zu erzeugen. Dieses System funktioniert dank des Transports von Elektronen aus Donorsubstanzen wie NADH+ gegenüber Rezeptorsubstanzen, in diesem Fall Sauerstoff.
Dies führt zur Produktion von Energie (ATP) und Wasser oder Wasserstoffperoxid, abhängig vom Cytochromoxidase-System, das der Mikroorganismus besitzt..
Deshalb sind die meisten Oxidase-positiven Bakterien auch Katalase-positiv, eine notwendige Bedingung, um das erzeugte Wasserstoffperoxid zu eliminieren, da diese Substanz für Bakterien toxisch ist..
Das Cytochromoxidase-c-System ist in einigen aeroben Bakterien, einigen fakultativen Anaerobier, wenigen mikroaerophilen und keinen strengen Anaerobier vorhanden. Letzteres ist verständlich, da strenge Anaerobier nicht in Gegenwart von Sauerstoff leben können und ihnen daher das Cytochromoxidase-System fehlt..
In diesem Test werden Substanzen verwendet, die als künstliche Elektronenakzeptoren wirken und natürliche innerhalb der Elektronentransportkette ersetzen..
Hauptsächlich werden Farbstoffe wie Paraphenylendiamin und Indophenol verwendet, die als Rezeptorsubstrate und künstliche Elektronendonoren wirken.
Paraphenylendiamin wird durch das Cytochromoxidase c-System oxidiert. Der Farbstoff in seiner reduzierten Form ist farblos, aber in seiner oxidierten Form ist er gefärbt.
Auf diese Weise wird das Vorhandensein des Cytochromoxidase-c-Systems nachgewiesen; da eine positive Reaktion je nach verwendetem Reagenz eine lavendelfarbene oder blau-lila Farbe erzeugt.
Wenn sich andererseits die letzte elektronenakzeptierende Substanz in der Atmungskette von Sauerstoff unterscheidet, ist der Oxidasetest negativ (es gibt keine Farbproduktion); Dies ist der Fall bei anaeroben Mikroorganismen.
Wenn sich das vom Mikroorganismus verwendete Cytochrom von der Cytochromoxidase c unterscheidet, ergibt sich ebenfalls der negative Test..
Es gibt verschiedene Reagenzien und Protokolle für den Oxidasetest, alle für den gleichen Zweck..
Kovacs-Reagenz, Gordon- und McLeod-Reagenz, Nadi-Reagenz, Carpenter-, Suhrland- und Morrison-Reagenz und Verwendung von Oxidase-Scheiben.
Es besteht aus 1% Tetramethyl-p-phenylendiamin-Dihydrochlorid.
Das Kovacs-Reagenz wird hergestellt, indem 1 g der oben genannten Substanz in 50 ml destilliertem Wasser gelöst wird. Es wird leicht erhitzt, bis es vollständig aufgelöst ist. In eine bernsteinfarbene Flasche mit ausreichendem Fassungsvermögen umfüllen und mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen. Warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie es verwenden. Im lichtgeschützten Kühlschrank aufbewahren.
Es ist als Kovacs-Oxidase-Reagenz gekennzeichnet, um es von dem Kovacs-Reagenz zu unterscheiden, das zur Aufdeckung des Indol-Tests verwendet wurde. Dieses Reagenz ist das empfindlichste, weniger toxische, aber teurer als die übrigen Reagenzien.
Eine positive Reaktion wird mit diesem Reagenz mit der Farbänderung der Kolonie zu Lavendel nachgewiesen, die schnell fast schwarz lila wird. Eine negative Reaktion ist offensichtlich, da es in der Kolonie keine Farbveränderung gibt oder eine leichte rosa Färbung annimmt. Das Medium kann sich auch verdunkeln, dies bedeutet jedoch keine positive Reaktion.
Bei diesem Reagenz ist die Reaktionszeit entscheidend, eine Farbänderung zwischen 5 und 15 Sekunden wird als positive Reaktion angesehen..
Es besteht aus Dimethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid, auch bekannt als N-Dimethyl-p-phenylendiamin oder p-Aminodimethylanilinmonohydrochlorid. Es wird wie für das Kovacs-Oxidase-Reagenz beschrieben hergestellt und ersetzt die betreffende Substanz..
Dieses Reagenz ist etwas stabiler als das Kovacs-Oxidase-Reagenz, obwohl alle Reagenzien, die p-Phenylendiamin enthalten, instabil sind..
Diese Reaktion ist später, sie wird als positiv mit dem Auftreten einer blau-lila Farbe innerhalb von 10 bis 30 Minuten interpretiert..
Es besteht aus 1% α-Naphthol in Ethylalkohol (95% Ethanol) und 1% Aminodimethylanilin. Die Mischung wird zu gleichen Teilen unter Verwendung von absolutem Ethylalkohol als Verdünnungsmittel hergestellt, bis die ausreichende Menge für 100 ml erreicht ist.
Es besteht aus 1% p-Aminodimethylalaninoxalat. Bereiten Sie es auf die gleiche Weise wie für das Kovacs-Oxidase-Reagenz beschrieben vor und wechseln Sie es für die entsprechende Substanz.
Wenn die Lösung fertig ist, bereiten Sie die Teststreifen wie folgt vor: 6-8 cm Whatman Nr. 1-Filterpapierstreifen werden mit 1% Dimethyl-p-phenylendiaminoxalat-Reagenz imprägniert.
Sie werden ohne Kontakt mit Metall trocknen gelassen, in Schraubgläsern mit Trockenmittel aufbewahrt und im Kühlschrank aufbewahrt. Diese Streifen sind bis zu 6 Monate haltbar.
Es ist das stabilste Reagenz aller genannten und kann in Lösung bis zu 6 Monate halten. Ein weiterer Pluspunkt ist, dass das Medium um die Kolonie nicht gefärbt wird, wenn es direkt auf der Platte verwendet wird.
Das Auftreten einer roten Farbe wird als positiver Test interpretiert.
Es handelt sich um handelsübliche Scheiben, die für den Oxidasetest mit Reagenz imprägniert sind. Es gibt mehrere Handelsmarken auf dem Markt.
Die Verwendung ist sehr praktisch, da keine frischen Reagenzien hergestellt werden müssen, was die Arbeit erleichtert. Die erhaltenen Ergebnisse sind zuverlässig, solange die Scheiben ordnungsgemäß aufbewahrt werden.
Direkte Plattenmethode, indirekte Methode auf Papier und Verwendung von mit Oxidase-Reagenzien imprägnierten Scheiben.
Zu diesem Zweck werden 2 oder 3 Tropfen eines der oben genannten Reagenzien direkt auf die Kolonie (n) gegeben, die in einer Platte aus Kulturmedium enthalten sind, die keine Glucose enthält..
Die Veränderung oder Nichtveränderung der Farbe der Kolonien wird interpretiert, nicht des Mediums. Die gültige Reaktionszeit hängt vom verwendeten Reagenz ab.
Schneiden Sie ein Stück Filterpapier (Whatman Nr. 1) auf eine Größe von 6 cmzwei und in eine leere Petrischale gelegt.
2 oder 3 Tropfen des Kovacs-Oxidase-Reagens auf das Papier geben, mit einem Platingriff oder einem Holzzahnstocher an der zu untersuchenden Kolonie teilnehmen und diese geradlinig auf dem mit Reagenz imprägnierten Papier verteilen. Führen Sie innerhalb von 5-10 Sekunden durch.
Mit den mit Carpenter-, Suhrland- und Morrison-Reagenz hergestellten Streifen wird eine Kolonie auf dem trockenen Streifen verteilt. Ein einzelner Streifen wird verwendet, um mehrere Stämme zu testen. In 10 Sek. Interpretieren.
Befeuchten Sie die handelsüblichen Scheiben subtil mit sterilem destilliertem Wasser und überlagern Sie die zu untersuchende Kolonie. Es wird empfohlen, die Platten bei 35 ° C zu verwenden. Wenn Platten bei Raumtemperatur oder gekühlte Platten verwendet werden, ist die Reaktion etwas langsamer. Interpretieren Sie den Farbwechsel zwischen 10 und 20 Sekunden.
In Blut oder Schokoladenagar enthaltene Kolonien können verwendet werden.
Befeuchten Sie die Disc wie zuvor beschrieben. Legen Sie es in eine leere Petrischale. Nehmen Sie eine ausreichende Menge der Kolonie, um sie mit einem Platingriff oder einem hölzernen Zahnstocher zu untersuchen, und legen Sie sie auf die Scheibe. Interpretieren Sie den Farbwechsel zwischen 10 und 20 Sekunden.
Die Gattungen Neisseria und Acinetobacter sind morphologisch manchmal sehr ähnlich, denn obwohl die Gattung Acinetobacter ein gramnegativer Stab ist, kann sie manchmal eine kokkoidale Form annehmen und paarweise verteilt werden, wodurch die Gattung Neisseria simuliert wird..
In diesem Fall ist der Oxidasetest wirklich nützlich. Die Gattung Neisseria ist positiv und Acinetobacter negativ.
Die Gattung Moraxella ist jedoch der Gattung Neisseria sehr ähnlich und beide reagieren positiv; Aus diesem Grund müssen zur endgültigen Identifizierung immer Kohlenhydratfermentationstests durchgeführt werden.
Andererseits ist der Oxidasetest nützlich, um ein Bakterium der Enterobacteriaceae-Familie (alle Oxidase-negativ) von anderen Fermentern wie der Gattung Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (Oxidase-positiv) zu unterscheiden..
Die Gattungen Vibrio und Helicobacter sind ebenfalls Oxidase-positiv.
Verwenden Sie bekannte Stämme von Escherichia coli als negative Kontrolle und Stämme von Pseudomonas aeruginosa als positive Kontrolle.
-Die Reagenzien müssen frisch zubereitet verwendet werden, ihre Haltbarkeit in Lösung bei Raumtemperatur ist kurz, da sie sehr instabil sind. Gekühlt können sie zwischen 5 Tagen und 2 Wochen dauern.
-Die Reagenzien sind farblos. Wenn sie ihre Farbe ändern, müssen sie verworfen werden. Beschädigte Discs sind offensichtlich, da sie mit der Zeit dunkler werden.
-Eine positive Reaktion mit dem Kovacs-Oxidase-Reagenz zwischen 15 und 60 Sekunden wird als verzögerte Reaktion angesehen und sollte nach 60 Sekunden als negativ angesehen werden.
-Das Haemophylus influenzae ergibt eine negative Oxidase-Reaktion, wenn ein Reagenz mit Dimethyl-p-phenylendiamin verwendet wird, aber positiv, wenn das Kovacs-Oxidase-Reagenz (Tetramethyl-p-phenylendiamin) verwendet wird.
-Glukosehaltige Medien stören den Test und führen zu falsch negativen Ergebnissen.
-Stämme von Bordetella pertussis kann eine falsch positive Reaktion hervorrufen, wenn sie von hochkonzentrierten Blutagarplatten stammen.
-Die Verwendung von Metallgriffen (Eisengriffen) führt zu einer falsch positiven Reaktion.
-Da die Reagenzien sehr instabil sind und zur Selbstoxidation neigen, wird empfohlen, Aliquots von 1 bis 2 ml einzufrieren und bei Bedarf zu entfernen..
-Eine andere Möglichkeit, die Autooxidation des Reagens zu verzögern, besteht darin, bei der Herstellung der Reagenzien 0,1% Ascorbinsäure zuzusetzen..
-Da die Reagenzien instabil sind, wird eine wöchentliche Qualitätskontrolle empfohlen..
-Reagenzien, die den Qualitätskontrolltest nicht bestehen, sollten nicht verwendet werden..
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