Das Katalasetest ist eine Methode, die in bakteriologischen Labors verwendet wird, um das Vorhandensein des Katalaseenzyms in den Bakterien, die es besitzen, aufzudecken. Zusammen mit der Gram-Färbung sind sie die Haupttests, die an neu isolierten Mikroorganismen durchgeführt werden sollten. Diese Tests führen den Mikrobiologen zu den Schritten, die zur endgültigen Identifizierung des betreffenden Mikroorganismus zu befolgen sind..
Im Allgemeinen besitzen Bakterien, die Cytochrom enthalten, das Enzym Katalase, was bedeutet, dass fakultative aerobe und anaerobe Bakterien es besitzen sollten. Es gibt jedoch Ausnahmen wie Streptococcus, die trotz ihrer fakultativen anaeroben Mikroorganismen nicht über das Enzym Katalase verfügen.
Aus diesem Grund wird der Katalasetest hauptsächlich verwendet, um die Staphylococaceae- und Micrococaceae-Familien (beide Katalase-positiv) von der Streptococaceae-Familie (Katalase-negativ) zu unterscheiden..
Ebenso unterscheidet sich die Gattung Bacillus (Katalase positiv) unter anderem von der Gattung Clostridium (Katalase negativ).
Artikelverzeichnis
Katalase ist ein Enzym, das als Hydroperoxidase klassifiziert ist. Dies bedeutet, dass sie Wasserstoffperoxid (H) verwendenzweiODERzwei).
Es wird auch als Oxidoreduktase angesehen, da in der Reaktion, an der es beteiligt ist, ein Element als Elektronendonor (reduzierende Substanz) und ein anderes als Elektronenrezeptor (oxidierende Substanz) vorhanden ist..
Katalase ist ein Protein, das eine Proser-Gruppe mit vier dreiwertigen Eisenatomen (Fe) enthält+++), daher ist es ein Homoprotein. Das Eisen (III) -Ion bleibt während der Reaktion oxidiert.
Man kann sagen, dass Katalase ein entgiftendes Enzym ist, da seine Funktion darin besteht, Substanzen zu eliminieren, die während des bakteriellen Metabolismus produziert werden und für Bakterien toxisch sind. Zu diesen Substanzen gehört Wasserstoffperoxid.
Wasserstoffperoxid entsteht beim aeroben Abbau von Zuckern. Dieser Vorgang läuft wie folgt ab:
Das Superoxidion (O.zwei-) (freies Radikal) wird als Endprodukt der aeroben Assimilation von Glucose gebildet. Dies ist toxisch und wird durch das Enzym Superoxiddismutase eliminiert, das es in gasförmigen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid umwandelt.
Wasserstoffperoxid ist auch für Bakterien giftig und muss entfernt werden. Das Enzym Katalase zerlegt Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff.
Katalase kann auf andere Substrate als Wasserstoffperoxid wie Alkohole, Aldehyde, Säuren, aromatische Amine und Phenole einwirken. Wasserstoffperoxid kann jedoch auch von Katalase verwendet werden, um andere toxische Verbindungen wie Methyl- und Ethylalkohol zu oxidieren..
Ebenso ist Katalase in phagozytischen Zellen vorhanden und schützt sie vor der toxischen Wirkung von Wasserstoffperoxid..
3% Wasserstoffperoxid (10 Volumina).
Mikroskop-Objektträger
Einweg-Kunststoffgriff oder Holzzahnstocher.
Nehmen Sie eine ausreichende Menge der Kolonie, um sie zu untersuchen, ohne den Agar zu berühren, von dem sie stammt. Die Kolonie muss frisch sein, dh aus einer Kultur von 18 bis 24 Stunden.
Legen Sie die Kolonie auf den trockenen Objektträger und geben Sie einen Tropfen 3% iges Wasserstoffperoxid hinzu (Sie können auch H verwendenzweiODERzwei 30%). Beobachten Sie sofort, ob Blasen freigesetzt werden oder nicht.
Positive Reaktion: Gasentwicklung, nachgewiesen durch Blasenbildung (starkes Blasenbildung).
Negative Reaktion: keine Blasenbildung.
1 ml H einfüllenzweiODERzwei 3% auf einer reinen Platten- oder Keilkultur, die kein Blut enthält (vorzugsweise Nähragar). Beobachten Sie sofort, ob sich Blasen bilden. Sie können auch H verwendenzweiODERzwei 30%.
Es wird genauso interpretiert wie die Porta-Objektmethode.
Füllen Sie ein 67 mm Kapillarröhrchen bis zu einer Höhe von 20 mm mit 3% Wasserstoffperoxid durch Kapillarität.
Berühren Sie die zu untersuchende isolierte Kolonie mit der mit H gefüllten KapillarezweiODERzwei um 3%. Beobachten Sie, ob sich die Kapillare in ca. 10 Sekunden mit Blasen füllt. Diese Methode ermöglicht die Halbquantifizierung der Reaktion in Kreuzen:
Keine Kreuze, keine Blasen (negative Reaktion).
+ --Wenige Blasen (schwache oder verzögerte Reaktion).
++ -Reichlich vorhandene Blasen (mäßige Reaktion).
+++ -Blasen erreichen das entgegengesetzte Extrem (energetische Reaktion).
Auf einen sauberen, trockenen Objektträger legen Sie eine isolierte Kolonie und dann einen Tropfen H.zweiODERzwei 0,5% und mit einem Deckglas abdecken. Beobachten Sie, ob sich eingeschlossene Blasen bilden oder nicht.
Interpretation: Das Vorhandensein von Blasen zeigt eine positive Reaktion an. Keine Blasen, es wird als negative Reaktion interpretiert.
Diese Technik muss durch Steuern des pH-Werts und der Temperatur durchgeführt werden. Es muss unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, da die Manipulation der verschiedenen Mycobacterium-Arten gefährlich ist.
Wasserstoffperoxid 30% oder 110 Volumina (Superoxal).
Phosphatpuffer pH 7
10% Tween 80
Mycobacterium-Keilkultur für 3 bis 4 Wochen
Wiegen:
1,361 g (KHzweiPO4) wasserfreies Monokaliumphosphat.
1,420 g wasserfreies Dinatriumphosphat (Na 2 HPO 3).
Beide Salze in etwas sterilem destilliertem Wasser lösen und mit Wasser auf 1000 ml auffüllen.
Führen Sie eine 1:10 Verdünnung des kommerziell konzentrierten Tween 80 durch. Gehen Sie dazu wie folgt vor:
Nehmen Sie 1 ml Tween 80 und legen Sie es in etwas destilliertes Wasser, lösen Sie es auf und füllen Sie das Volumen mit Wasser bis zu 10 ml auf.
Mischen Sie eine Menge Phosphatpuffer mit einer Menge von 10% Tween 80 (zu gleichen Teilen). Definieren Sie im Labor, wie viel Sie vorbereiten möchten.
5 ml Phosphatpuffer in ein steriles Reagenzglas mit Schraubverschluss (Bakelit) geben..
Nehmen Sie mit einer Inokulationsschleife genügend Kolonie eines Mycobacterium-Wachstums, das in Keilen ausgesät ist, und lösen Sie sich im Phosphatpuffer auf.
Verschließen Sie das Rohr, ohne das Gewinde zu fest anzuziehen. 20 bis 30 Minuten in ein Wasserbad bei 68 ° C stellen. Entfernen und auf 22-25 ° C abkühlen lassen
Messen Sie 0,5 ml des endgültigen Reagenzes (mischen) und geben Sie es mit der kalten Lösung in das Röhrchen. Beobachten Sie die Bildung von Blasen oder nicht.
Es wird genauso interpretiert wie die vorherigen Techniken.
Wenn das Koloniewachstum in angereicherten Medien erhalten wird, müssen eine Gram-Färbung und ein Katalasetest an den erhaltenen Kolonien durchgeführt werden. Dies wird den Mikrobiologen zu den Verfahren führen, die zur endgültigen Identifizierung zu befolgen sind..
Verwenden Sie frisch kultivierte Kontrollstämme, wie z Staphylococcus aureus als positive Kontrolle und Stämme von Streptococcus sp als negative Kontrolle.
Eine andere Alternative, die als positive Kontrolle dient, besteht darin, einen Tropfen Wasserstoffperoxid auf den Blutagar zu geben. Die Erythrozyten haben Katalase. Wenn das Reagenz in gutem Zustand ist, kommt es daher zu einer Blasenbildung.
Ein Schokoladenagar kann als Negativkontrolle verwendet werden, hier sind die Erythrozyten bereits lysiert und der Test ist negativ.
-Verwenden Sie keine alten Kulturen für den Test, da dies zu falsch negativen Ergebnissen führen kann.
-Vermeiden Sie die Entnahme von Kolonien aus Blutagarkulturen, wenn Sie darauf achten, den Agar nicht zu berühren. Dieses Verfahren kann zu falsch positiven Ergebnissen führen, da Erythrozyten Katalase enthalten.
-Wenn Sie die Platinschleife Köln nehmen, kehren Sie die Reihenfolge des Verfahrens nicht um, da dies zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Dies liegt daran, dass Platin in der Lage ist, mit Wasserstoffperoxid zu reagieren und ein Blasen zu verursachen..
-Verwenden Sie das Wasserstoffperoxid-Reagenz nicht, wenn es sehr alt ist, da das Reagenz sehr instabil ist und im Laufe der Zeit zum Abbau neigt..
-Lagern Sie das Wasserstoffperoxid-Reagenz lichtgeschützt und gekühlt, um Beschädigungen zu vermeiden..
-Führen Sie bei jeder Verwendung eine Qualitätsprüfung des Wasserstoffperoxid-Reagens durch.
-Berücksichtigen Sie, dass, wenn die H.zweiODERzwei bei 30% sind die Reaktionen stärker als die mit H durchgeführtenzweiODERzwei um 3%.
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