EIN DNA-Microarray, Es wird auch als DNA-Chip oder DNA-Microarray bezeichnet und besteht aus einer Reihe von DNA-Fragmenten, die auf einem physischen Träger aus variablem Material, entweder Kunststoff oder Glas, verankert sind. Jedes DNA-Stück repräsentiert eine Sequenz, die zu einem bestimmten Gen komplementär ist.
Das Hauptziel von Microarrays ist die vergleichende Untersuchung der Expression bestimmter interessierender Gene. Beispielsweise ist es üblich, dass diese Technik auf zwei Proben angewendet wird - eine unter gesunden und eine pathologische -, um zu identifizieren, welche Gene exprimiert werden und welche nicht in der Probe mit der Bedingung sind. Diese Probe kann eine Zelle oder ein Gewebe sein.
Im Allgemeinen kann die Genexpression dank der Verwendung fluoreszierender Moleküle nachgewiesen und quantifiziert werden. Die Manipulation der Chips erfolgt in den meisten Fällen per Roboter und eine große Anzahl von Genen kann gleichzeitig analysiert werden.
Diese neuartige Technologie eignet sich für eine Vielzahl von Disziplinen, von der medizinischen Diagnostik bis zu verschiedenen molekularbiologischen Studien auf den Gebieten der Proteomik und Genomik..
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DNA-Mikroarrays (Desoxyribonukleinsäure) sind ein Satz spezifischer DNA-Segmente, die an eine feste Matrix gebunden sind. Diese Sequenzen ergänzen die Gene, die untersucht werden sollen, und es können bis zu 10.000 Gene pro cm vorhanden seinzwei.
Diese Eigenschaften ermöglichen die systematische und umfassende Untersuchung der Genexpression eines Organismus..
Die Informationen, die eine Zelle benötigt, um zu funktionieren, werden in Einheiten codiert, die als "Gene" bezeichnet werden. Bestimmte Gene enthalten Anweisungen zur Erzeugung essentieller biologischer Moleküle, die als Proteine bezeichnet werden..
Ein Gen wird exprimiert, wenn seine DNA in ein intermediäres Messenger-RNA-Molekül transkribiert wird und die Expression des Gens in Abhängigkeit vom Transkriptionsgrad dieses DNA-Segments variieren kann. In bestimmten Fällen kann die Änderung der Expression auf Krankheiten hinweisen.
Das Prinzip der Hybridisierung ermöglicht den Betrieb von Microarrays. DNA ist ein Molekül, das aus vier Arten von Nukleotiden besteht: Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin..
Zur Bildung der Doppelhelixstruktur gruppieren sich Adenine zusammen mit Thymin und Cytosin mit Guanin. Somit können zwei komplementäre Ketten durch Wasserstoffbrücken verbunden werden..
In Bezug auf die Struktur der Microarrays gibt es zwei Variationen: die kundenspezifischen komplementären DNA- oder Oligonukleotidverbindungen und die kommerziellen Microarrays mit hoher Dichte, die von kommerziellen Unternehmen wie Affymetrix GeneChip hergestellt werden..
Der erste Typ eines Microarrays ermöglicht die Analyse von RNA aus zwei verschiedenen Proben auf einem einzelnen Chip, während die zweite Variante vom kommerziellen Typ ist und eine große Anzahl von Genen aufweist (zum Beispiel hat der Affymetrix GeneChip etwa 12.000 menschliche Gene) eine einzelne Probe analysieren.
Der erste Schritt bei der Durchführung eines Experiments unter Verwendung der Microarray-Technologie ist die Isolierung und Reinigung der RNA-Moleküle (es kann sich um Messenger-RNA oder andere Arten von RNA handeln)..
Wenn Sie zwei Proben vergleichen möchten (unter anderem gesund gegen krank, Kontrolle gegen Behandlung), muss das Molekül in beiden Geweben isoliert werden..
Anschließend wird die RNA in Gegenwart von markierten Nukleotiden einem reversen Transkriptionsprozess unterzogen, wodurch die komplementäre DNA oder cDNA erhalten wird..
Die Markierung kann fluoreszierend sein und muss zwischen den beiden zu analysierenden Geweben unterscheidbar sein. In herkömmlicher Weise werden die fluoreszierenden Verbindungen Cy3 und Cy5 verwendet, da sie Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen emittieren. Im Fall von Cy3 ist es eine Farbe nahe Rot und Cy5 entspricht dem Spektrum zwischen Orange und Gelb.
Die cDNAs werden gemischt und in dem DNA-Mikroarray inkubiert, um eine Hybridisierung (d. H. Es tritt eine Bindung auf) der cDNA aus beiden Proben mit dem Teil der DNA zu ermöglichen, der auf der festen Oberfläche des Mikroarrays immobilisiert ist..
Ein höherer Prozentsatz der Hybridisierung mit der Sonde im Microarray wird als höhere Gewebeexpression der entsprechenden mRNA interpretiert..
Die Quantifizierung der Expression erfolgt durch Einbau eines Lesesystems, das der von jeder cDNA emittierten Fluoreszenzmenge einen Farbcode zuweist. Wenn beispielsweise Rot verwendet wird, um den pathologischen Zustand zu markieren, und es in einem höheren Anteil hybridisiert, ist die rote Komponente die vorherrschende.
Mit diesem System ist es möglich, die Überexpression oder Repression jedes unter beiden ausgewählten Bedingungen analysierten Gens zu kennen. Mit anderen Worten kann das Transkriptom der im Experiment bewerteten Proben bekannt sein.
Microarrays gelten derzeit als sehr leistungsfähige Werkzeuge im medizinischen Bereich. Diese neue Technologie ermöglicht die Diagnose von Krankheiten und ein besseres Verständnis dafür, wie die Genexpression unter verschiedenen medizinischen Bedingungen verändert wird..
Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich eines Kontrollgewebes mit einem mit einem bestimmten Arzneimittel behandelten Gewebe, um die Auswirkungen einer möglichen medizinischen Behandlung zu untersuchen..
Dazu werden der Normalzustand und der Krankheitszustand vor und nach der Verabreichung des Arzneimittels verglichen. Durch die Untersuchung der Wirkung des Arzneimittels auf das Genom in vivo Sie haben einen besseren Überblick über den Wirkmechanismus. Es kann auch verstanden werden, warum bestimmte Medikamente zu unerwünschten Nebenwirkungen führen..
Krebs führt die Liste der mit DNA-Microarrays untersuchten Krankheiten an. Diese Methode wurde zur Klassifizierung und Prognose der Krankheit verwendet, insbesondere bei Leukämien..
Das Untersuchungsgebiet dieses Zustands umfasst die Kompression und Charakterisierung der molekularen Basen von Krebszellen, um Muster der Genexpression zu finden, die zu Fehlern bei der Regulation des Zellzyklus und bei den Prozessen des Zelltods (oder der Apoptose) führen..
Durch die Verwendung von Microarrays war es möglich, die unterschiedlichen Expressionsprofile von Genen bei Erkrankungen wie Allergien, primären Immundefekten, Autoimmunerkrankungen (wie rheumatoider Arthritis) und Infektionskrankheiten aufzuklären.
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