Das Harnstoffbrühe Es ist ein flüssiges Kulturmedium, das verwendet wird, um das Vorhandensein des Enzyms Urease in bestimmten Mikroorganismen zu zeigen. Urease ist ein mikrobielles Enzym, das konstitutiv produziert wird, dh es wird synthetisiert, unabhängig davon, ob das Substrat, auf das es wirkt, vorhanden ist oder nicht..
Die Funktion von Urease hängt mit der Zersetzung organischer Verbindungen zusammen. Nicht alle Mikroorganismen sind in der Lage, dieses Enzym zu synthetisieren, daher ermöglicht seine Bestimmung im Labor die Identifizierung bestimmter Bakterienstämme und sogar die Unterscheidung zwischen Arten derselben Gattung..
Es gibt zwei Arten von Harnstofftests: Stuart und Christensen. Sie unterscheiden sich in Zusammensetzung und Empfindlichkeit. Die erste ist speziell, um eine große Menge an Urease zu zeigen, die von Arten der Gattung Proteus produziert wird.
Die zweite ist empfindlicher und kann geringe Mengen an Urease nachweisen, die spät von anderen Bakteriengattungen wie Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter und Mycobacterium erzeugt werden.
Stuart's Harnstoffbrühe besteht aus Harnstoff, Natriumchlorid, Dikaliumphosphat, Monokaliumphosphat, Hefeextrakt, Phenolrot und destilliertem Wasser.
Inzwischen besteht Christensens Harnstoffbrühe oder Agar aus Peptonen, Natriumchlorid, Monokaliumphosphat, Glucose, Harnstoff, Phenolrot, destilliertem Wasser und Agar-Agar. Letzteres nur, wenn es sich um das feste Medium handelt.
Artikelverzeichnis
Das Enzym Urease hydrolysiert Harnstoff unter Bildung von Kohlendioxid, Wasser und zwei Ammoniakmolekülen. Diese Verbindungen reagieren unter Bildung des Endprodukts Ammoniumcarbonat..
Stuart's Harnstoffbrühe ist mit einem pH von 6,8 stärker gepuffert. Daher muss der Mikroorganismus in der Lage sein, große Mengen Ammoniak zu bilden, um Phenolrot zu färben. Der pH sollte über 8 steigen.
Daher ist Stuarts Harnstoffbrühe für Proteus-Arten selektiv und liefert innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der Inkubation positive Ergebnisse. Sie ist nicht wirksam für Bakterien, die geringe Mengen an Urease produzieren oder Harnstoff langsam hydrolysieren..
Dies liegt daran, dass Proteus-Arten Harnstoff als Stickstoffquelle verwenden können. Stattdessen benötigen andere Urease-produzierende Bakterien eine zusätzliche Quelle.
Pérez et al. (2002) stellten fest, dass Stuarts Harnstoffbrühe genauso effizient war wie Christensens Harnstoffagar, um Urease in Hefestämmen der Gattungen Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon und Saccharomyces zu bestimmen.
Die Autoren der Studie behaupten, bei 24- und 48-stündiger Inkubation eine 100% ige Übereinstimmung mit beiden Medien (Stuart und Christensen) erreicht zu haben; mit der Ausnahme, dass die Stämme, die es schafften, das Medium in eine starke rosa-fuchsia Farbe zu verwandeln, als positiv bewertet wurden.
Diese Klarstellung ist notwendig, da Lodder (1970) feststellte, dass es fast allen Hefen gelingt, die Abschrägung von Christensens Harnstoffagar in blassrosa zu verwandeln. Dies liegt an der Tatsache, dass sie Harnstoff in winzigen Mengen hydrolysieren können, und an der Bildung von Aminen durch oxidative Decarboxylierung der Aminosäuren auf der Oberfläche. Dies sollte nicht als positiv ausgelegt werden.
Christensens Harnstoffbrühe oder Agar ist weniger gepuffert und kann geringe Mengen Ammoniak nachweisen. Darüber hinaus ist dieses Medium mit Peptonen und Glucose angereichert. Diese Verbindungen lassen andere Urease-produzierende Mikroorganismen wachsen, die nicht in Stuart-Brühe wachsen..
Ebenso bietet der Christensen-Harnstofftest schnellere Ergebnisse, insbesondere für Proteus, da er in nur 30 Minuten als minimale Zeit und bis zu 6 Stunden als maximale Zeit stark positiv sein kann.
Der Rest der Urease-produzierenden Mikroorganismen kann die Farbe des Mediums nach 6 Stunden leicht und nach 24, 48, 72 Stunden oder mehr stark verändern, und selbst einige Stämme können nach 5 oder 6 Tagen schwache Reaktionen hervorrufen.
Das Medium hat ursprünglich eine gelb-orange Farbe und eine positive Reaktion wird die Farbe des Mediums in Pink-Fuchsia verwandeln. Die Intensität der Farbe ist direkt proportional zur Menge des erzeugten Ammoniaks.
Bei einer negativen Reaktion bleibt das Medium mit der ursprünglichen Farbe zurück, mit Ausnahme von Hefen, die auf Christensens Harnstoff-Agarmedium blassrosa werden können..
Wiegen Sie die erforderlichen Gramm gemäß den Angaben des Handelsunternehmens. In vorzugsweise sterilem destilliertem Wasser lösen. Verwenden Sie keine Wärme zum Auflösen, da Harnstoff hitzeempfindlich ist.
Das Membranfiltrationsverfahren wird zum Sterilisieren verwendet. Hierzu wird ein Millipore-Filter mit Poren von 0,45 µ Durchmesser verwendet. Verwenden Sie keinen Autoklaven. Sobald die Lösung filtriert ist, wird sie in sterile Röhrchen verteilt. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, sollte es zwischen 1,5 ml als Mindestmenge und 3 ml als Höchstmenge pro Röhrchen übertragen werden..
Im Kühlschrank lagern und vor Gebrauch aufwärmen..
Wenn die Filtrationsmethode nicht verfügbar ist, sollte das Medium sofort verwendet werden, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen..
Eine andere Möglichkeit, Stuarts Harnstoffbrühe zuzubereiten, ist folgende:
Einige Handelshäuser verkaufen das Basismedium für den Harnstofftest ohne Harnstoff..
Die vom Handelsunternehmen angegebene Menge wird gewogen. Es wird in destilliertem Wasser gelöst und im Autoklaven 15 Minuten bei 121 ° C sterilisiert. Lassen Sie es etwas ruhen und geben Sie bei warmem Medium 100 ml einer 20% igen Harnstofflösung hinzu, die durch Filtration sterilisiert wurde..
Es wird wie zuvor beschrieben in sterilen Röhrchen verteilt.
29 g dehydrierten Harnstoff abwiegen und in 100 ml destilliertem Wasser lösen. Verwenden Sie die Filtrationsmethode zum Sterilisieren. Nicht autoklavieren.
24 g des dehydrierten Basisagars werden in 950 ml destilliertem Wasser gelöst. Im Autoklaven 15 Minuten bei 121 ° C sterilisieren. Lassen Sie es stehen, bis es eine Temperatur von 50 ° C erreicht hat, und geben Sie den zuvor zubereiteten Harnstoff aseptisch hinzu.
Gießen Sie 4 bis 5 ml in sterile Röhrchen und kippen Sie, bis es fest ist. Es sollte einen langen Flötenschnabel geben.
Dieses Medium kann auch in flüssiger Form hergestellt werden.
Der Harnstofftest ist angesichts der schnellen Reaktion von Proteus äußerst wirksam bei der Unterscheidung der Gattung Proteus von anderen Gattungen in der Familie der Enterobacteriaceae..
Unter Verwendung der Christensen-Zusammensetzung hilft der Test, zwischen Arten derselben Gattung zu unterscheiden. Beispielsweise, S. haemolyticus und S. warneri sauf Staphylococcus Koagulase negativ und beta-hämolytisch, aber sie unterscheiden sich darin S. haemolyticus ist Harnstoff negativ und S. warneri ist Harnstoff positiv.
Andererseits verwendete McNulty erfolgreich Christensens 2% ige Harnstoffbrühe, um das Vorhandensein von zu untersuchen Helicobacter pylori in Biopsieproben aus der Magenschleimhaut (Antrumregion).
Das Vorhandensein von H. pylori Dies wird durch einen positiven Harnstofftest belegt. Die Zeitdauer zur Beobachtung der Ergebnisse ist direkt proportional zur Menge der vorhandenen Mikroorganismen.
Wie zu sehen ist, handelt es sich um eine einfache Methode zur Diagnose von Helicobacter pylori bei Magenbiopsien.
Schließlich ist dieser Test auch nützlich, um Arten der Gattungen Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus und Mycobacteria zu unterscheiden..
Beide Methoden erfordern ein starkes mikrobielles Inokulum, um die Ergebnisse zu optimieren. Bakterienkolonien werden mit wenigen Ausnahmen vorzugsweise aus Blutagar und Hefen aus Sabouraud-Agar entnommen. Das Inokulum wird im flüssigen Medium emulgiert.
Für Stuarts Harnstoffbrühe 24 bis 48 Stunden bei 37 ° C inkubieren, da Sie wissen, dass Sie nur dann nach Stämmen der Gattung Proteus suchen, wenn es sich bei dem Stamm um ein Bakterium handelt. Für Hefen kann es bei 37 ° C oder bei Raumtemperatur für 24 bis 48 Stunden Inkubation inkubiert werden.
Im Fall von Christensens Harnstoffbrühe wird sie 24 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Wenn der Test negativ ist, kann er bis zu 6 Tage inkubiert werden. Wenn der Test vor 6 Stunden positiv ist, zeigt dies an, dass es sich um einen Stamm der Gattung Proteus handelt.
Im Fall von Christensens Harnstoffagar wird die Abschrägung des Agars stark geimpft, ohne zu punktieren. Die Brühe wird auf die gleiche Weise inkubiert und interpretiert.
Kontrollstämme wie Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 und Salmonella typhimurium. Die ersten beiden sollten positive und die letzten beiden negativen Ergebnisse liefern..
Bisher hat noch niemand einen Kommentar zu diesem Artikel abgegeben.