Das Sporenfärbung Es ist die Methode, mit der die Resistenzstrukturen gefärbt werden, die unter ungünstigen Bedingungen einige Bakteriengattungen bilden. Diese Strukturen entsprechen einer Form des Überlebens.
Es gibt viele Gattungen, die Sporen bilden; Die wichtigsten sind jedoch Bacillus und Clostridium. Diese Gattungen werden als relevanter angesehen, da sie Arten haben, die für den Menschen pathogen sind..
Jeder Bazillus kann zu einer Spore führen. Zum Zeitpunkt der Färbung des Präparats befindet sich die Spore innerhalb oder außerhalb des Bazillus (Endospore) oder außerhalb des Bazillus (Exospore). Bei herkömmlichen Färbetechniken für Bakterien - wie der Gram-Färbung - bleiben die Sporen farblos.
Gegenwärtig gibt es verschiedene Färbemethoden, die in der Lage sind, die dicke Struktur der Spore zu durchdringen, um sie zu färben. Diese Methoden sind sehr unterschiedlich; Dazu gehören die Dorner-Technik, die Möeller-Färbung und die Shaeffer-Fulton-Methode, auch bekannt als Wirtz-Conklin..
Von allen genannten Techniken wird die Shaeffer-Fulton-Methode in Routinelabors am häufigsten verwendet. Es ist nach zwei Mikrobiologen benannt, die 1930 die Färbung kreierten: Alicia Shaeffer und MacDonald Fulton. Die Technik wird jedoch manchmal Wirtz-Conklin zu Ehren von zwei Bakteriologen aus den 1900er Jahren genannt..
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Die Sporen färben sich nicht mit herkömmlichen Flecken, da sie eine sehr dicke Wand haben. Die komplexe Zusammensetzung der Sporen verhindert den Eintritt der meisten Farbstoffe.
Wenn die Spore von außen nach innen untersucht wird, werden die folgenden Schichten beobachtet: Erstens das Exosporium, das die dünnste und äußerste Schicht ist, die von Glykoproteinen gebildet wird.
Als nächstes kommt die Nagelhaut, die gegen hohe Temperaturen resistent ist, gefolgt von der aus Peptidoglycan bestehenden Kortikalis. Später befindet sich die Wand der Basis, die den Protoplasten schützt.
Die Spore ist eine dehydrierte Struktur, die 15% Calcium und Dipicolinsäure enthält. Aus diesem Grund beruhen die meisten Sporenfärbetechniken auf der Anwendung von Wärme, damit der Farbstoff die dicke Struktur durchdringen kann..
Sobald die Spore gefärbt ist, kann sie den Farbstoff nicht mehr entfernen. Bei der Shaeffer-Fulton-Technik dringt Malachitgrün in vegetative Zellen ein und dringt bei Hitzeeinwirkung auch in die Endospore und die Exosporen ein..
Durch Waschen mit Wasser wird der Farbstoff aus der vegetativen Zelle entfernt. Dies liegt daran, dass der Malachitgrün-Farbstoff leicht basisch ist und sich daher schwach an die vegetative Zelle bindet..
Stattdessen kann es nicht aus der Spore austreten und der Bazillus wird schließlich mit Safranin gegengefärbt. Diese Grundlage gilt für den Rest der Techniken, bei denen etwas Ähnliches passiert.
Um die Sporenfärbung durchzuführen, müssen Sie eine Reinkultur des verdächtigen Stammes haben, den Sie untersuchen möchten..
Die Kultur wird 24 Stunden lang extremen Temperaturen ausgesetzt, um den Mikroorganismus zur Sporulation anzuregen. Hierzu kann die Kultur 24 oder 48 Stunden in einen Ofen bei 44 ° C oder in einen Kühlschrank (8 ° C) gestellt werden..
Wenn bei den genannten Temperaturen zu lange belassen wird, werden nur Exosporen beobachtet, da alle Endosporen den Bazillus bereits verlassen haben.
Am Ende der Zeit sollten einige Tropfen sterile physiologische Lösung auf einen sauberen Objektträger gegeben werden. Dann wird ein kleiner Teil der Kultur entnommen und ein feiner Aufstrich gemacht.
Es wird dann trocknen gelassen, in die Hitze gesetzt und mit einer der nachstehend erläuterten Techniken gefärbt:
1- Bereiten Sie eine konzentrierte Suspension des sporulierten Mikroorganismus in destilliertem Wasser in einem Reagenzglas vor und geben Sie ein gleiches Volumen gefiltertes Kinyoun-Carbolfuchsin hinzu.
2- Stellen Sie das Röhrchen 5 bis 10 Minuten lang in ein kochendes Wasserbad.
3- Mischen Sie auf einem sauberen Objektträger einen Tropfen der vorherigen Suspension mit einem Tropfen einer 10% igen wässrigen Lösung von Nigrosin, gekocht und filtriert..
4- Bei milder Hitze schnell verteilen und trocknen.
5- Mit einem 100X-Objektiv untersuchen (Eintauchen).
Sporen färben sich rot und Bakterienzellen erscheinen vor einem dunkelgrauen Hintergrund fast farblos.
1- Eine Suspension des sporulierten Mikroorganismus wird auf einem Objektträger verteilt und in der Hitze fixiert.
2- Die Probe wird mit einem Filterpapierstreifen bedeckt, dem Carbolfuchsin zugesetzt wird. Das Färbemittel wird 5 bis 7 Minuten mit der Flamme des Bunsenbrenners erhitzt, bis die Entwicklung von Dämpfen erzeugt wird. Dann wird das Papier entfernt.
3- Das Präparat wird mit Wasser gewaschen und dann mit saugfähigem Papier getrocknet.
4- Decken Sie den Abstrich mit einem dünnen Film aus 10% Nigrosin ab und verteilen Sie das Nigrosin oder eine Nadel mit einem zweiten Objektträger.
Die Färbung, die Sporen und Bakterien annehmen, ist dieselbe wie die im Stand der Technik beschriebene.
1- Machen Sie einen feinen Abstrich mit einer Suspension des sporulierten Mikroorganismus auf einem Objektträger und fixieren Sie ihn auf Hitze.
2- Decken Sie den Objektträger mit 5% iger wässriger Malachitgrünlösung ab (ein Filterpapier kann auf den Objektträger gelegt werden)..
3- Erhitzen Sie die Flamme des Bunsenbrenners, um Dämpfe freizusetzen, und entfernen Sie die Flamme. Wiederholen Sie den Vorgang für 6 bis 10 Minuten. Wenn die Malachitgrün-Lösung während des Verfahrens zu stark verdunstet, mehr.
4- Entfernen Sie das Filterpapier (falls installiert) und waschen Sie es mit Wasser.
5- Decken Sie den Objektträger 30 Sekunden lang mit 0,5% igem wässrigem Safranin ab (einige Varianten der Technik verwenden 0,1% iges wässriges Safranin und lassen Sie ihn 3 Minuten lang stehen)..
Bei dieser Technik erscheinen die Sporen grün und die Bazillen rot..
Es hat den Nachteil, dass sich die Endosporen junger Kulturen nicht gut färben, da sie extrem klar oder farblos erscheinen. Um dies zu vermeiden, wird empfohlen, Kulturen mit einer Inkubationszeit von 48 Stunden zu verwenden..
1- Decken Sie den Abstrich 2 Minuten lang mit Chloroform ab.
2- Entsorgen Sie das Chloroform.
3- 5 Minuten mit 5% iger Chromsäure abdecken.
4- Mit destilliertem Wasser waschen
5- Das Blatt ist mit Carbolfuchsin-Fenicada bedeckt und bis zur Emission von Dämpfen der Flamme des Bunsenbrenners ausgesetzt. dann wird es für einige Momente aus der Flamme entfernt. Der Vorgang wird wiederholt, bis 10 Minuten abgeschlossen sind.
6- Mit Wasser waschen.
7- Verwenden Sie angesäuertes Ethanol (Salzalkohol) zum Verfärben. 20 oder 30 Sekunden einwirken lassen.
8- Mit destilliertem Wasser waschen.
9- Kontrastieren Sie, indem Sie das Blatt 5 Minuten lang mit Methylenblau bedecken.
10- Mit destilliertem Wasser waschen.
11- Lassen Sie es trocknen und nehmen Sie die Probe zum Mikroskop.
Die Sporen erscheinen rot und die Bazillen blau. Es ist wichtig, die Dämpfe nicht einzuatmen, da sie giftig sind und langfristig krebserregend sein können..
2007 entwickelten Hayama und seine Mitarbeiter eine Modifikation der Möeller-Technik. Sie eliminierten den Schritt des Erhitzens des Farbstoffs und ersetzten ihn durch Zugabe von 2 Tropfen des Tensids Tergitol 7 pro 10 ml Carbolfuchsin-Carbol-Lösung. Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten.
Die Färbung von Sporen liefert sehr wertvolle und nützliche Informationen für die Identifizierung des Pathogens, da sein Vorhandensein, seine Form, seine Position innerhalb des Bazillus und die Fähigkeit, die vegetative Zelle zu deformieren oder nicht, Daten sind, die die in a beteiligten Arten leiten können bestimmtes Genre.
In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass die Sporen rund oder oval sein können, sich in der Mitte oder auch in einer parazentralen, subminalen oder terminalen Position befinden können..
- Clostridium difficile bildet in Endposition eine ovale Spore, die den Bazillus deformiert.
- Die Spore von Clostridium Tertium es ist oval, verformt den Bazillus nicht und befindet sich auf der terminalen Ebene.
- Die Endospore von Clostridium Tetani ist endständig und verformt den Bazillus, wodurch das Aussehen eines Trommelstocks entsteht.
- Sporen von Clostridium botulinum, C.. Histolyticum, C.. Novy Y. C. septicum Sie sind rund oder oval und verformen den Bazillus.
- Die Endospore von Clostridium sordelli befindet sich in zentraler Position mit einer leichten Verformung.
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