Das Endonukleasen Sie sind Enzyme, die die Phosphodiesterbindungen innerhalb der Nukleotidkette abschneiden. Endonuklease-Restriktionsstellen sind sehr unterschiedlich. Einige dieser Enzyme schneiden DNA (Desoxyribonukleinsäure, unser genetisches Material) fast überall, das heißt, sie sind unspezifisch.
Im Gegensatz dazu gibt es eine andere Gruppe von Endonukleasen, die in der Region oder Sequenz, die sie spalten sollen, sehr spezifisch sind. Diese Gruppe von Enzymen ist als Restriktionsenzyme bekannt und in der Molekularbiologie sehr nützlich. In dieser Gruppe haben wir die bekannten Enzyme Bam HI, Eco RI und Alu I..
Im Gegensatz zu Endonukleasen gibt es eine andere Art von katalytischen Proteinen - Exonukleasen -, die für das Aufbrechen der Phosphodiesterbindungen am Ende der Kette verantwortlich sind.
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Restriktionsendonukleasen oder Restriktionsenzyme sind katalytische Proteine, die für die Spaltung der Phosphodiesterbindungen innerhalb der DNA-Kette in sehr spezifischen Sequenzen verantwortlich sind.
Diese Enzyme können von mehreren Biotechnologieunternehmen bezogen werden und ihre Verwendung ist bei aktuellen DNA-Manipulationstechniken nahezu unverzichtbar..
Restriktionsendonukleasen werden mit den ersten Buchstaben des binomialen wissenschaftlichen Namens des Organismus benannt, aus dem sie stammen, gefolgt vom Stamm (dies ist optional) und enden mit der Gruppe der Restriktionsenzyme, zu denen sie gehören. Beispielsweise sind BamHI und EcoRI weit verbreitete Endonukleasen..
Die Region der DNA, die das Enzym erkennt, wird als Restriktionsstelle bezeichnet und ist für jede Endonuklease einzigartig, obwohl mehrere Enzyme an den Restriktionsstellen zusammenfallen können. Diese Stelle besteht im Allgemeinen aus einer kurzen palindromischen Sequenz mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren, wie AGCT (für Alu I) und GAATTC für Eco RI..
Palindromische Sequenzen sind Sequenzen, die zwar in 5'- bis 3'- oder 3'- bis 5'-Richtung gelesen werden, aber identisch sind. Für den Fall von Eco RI lautet die palindromische Sequenz beispielsweise: GAATTC und CTTAAG.
Zum Glück für Molekularbiologen haben Bakterien im Laufe der Evolution eine Reihe von Restriktionsendonukleasen entwickelt, die das genetische Material intern fragmentieren.
In der Natur haben sich diese Enzyme - vermutlich - als bakterielles Schutzsystem gegen das Eindringen von fremden DNA-Molekülen wie Phagen entwickelt.
Um zwischen nativem und fremdem genetischem Material zu unterscheiden, können diese Restriktionsendonukleasen spezifische Nukleotidsequenzen erkennen. Somit kann DNA, die diese Sequenz nicht aufweist, innerhalb des Bakteriums ungestört sein..
Wenn die Endonuklease dagegen die Restriktionsstelle erkennt, bindet sie an die DNA und schneidet sie..
Biologen sind daran interessiert, das genetische Material von Lebewesen zu untersuchen. DNA besteht jedoch aus mehreren Millionen Basenpaaren. Diese Moleküle sind extrem lang und müssen in kleinen Fragmenten analysiert werden..
Um dieses Ziel zu erreichen, werden Restriktionsendonukleasen in verschiedene molekularbiologische Protokolle integriert. Beispielsweise kann ein einzelnes Gen erfasst und für zukünftige Analysen repliziert werden. Dieser Prozess wird als "Klonen" eines Gens bezeichnet..
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen beziehen sich auf das Muster spezifischer Nukleotidsequenzen in DNA, die Restriktionsendonukleasen erkennen und schneiden können.
Dank der Spezifität der Enzyme ist jeder Organismus durch ein spezifisches Schnittmuster in der DNA gekennzeichnet, das ein Fragment variabler Länge erzeugt.
In der Vergangenheit wurden Restriktionsendonukleasen in drei Arten von Enzymen eingeteilt, die durch römische Ziffern gekennzeichnet sind. In letzter Zeit wurde ein vierter Typ von Endonuklease beschrieben.
Das wichtigste Merkmal von Typ I-Endonukleasen ist, dass es sich um Proteine handelt, die aus mehreren Untereinheiten bestehen. Jede dieser Funktionen fungiert als einzelner Proteinkomplex und weist normalerweise zwei Untereinheiten auf, die als R, zwei M und eine S bezeichnet werden.
Der S-Teil ist für die Erkennung der Restriktionsstelle in der DNA verantwortlich. Die R-Untereinheit ist ihrerseits für die Spaltung essentiell und M ist für die Katalyse der Methylierungsreaktion verantwortlich..
Es gibt vier Unterkategorien von Typ I-Enzymen, die unter den Buchstaben A, B, C und D bekannt sind und allgemein verwendet werden. Diese Klassifizierung basiert auf genetischer Komplementation.
Typ I-Enzyme waren die ersten Restriktionsendonukleasen, die entdeckt und gereinigt wurden. Am nützlichsten in der Molekularbiologie ist jedoch Typ II, der im nächsten Abschnitt beschrieben wird..
Restriktionsendonukleasen vom Typ II erkennen spezifische DNA-Sequenzen und spalten an einer konstanten Position in der Nähe einer Sequenz, die 5'-Phosphate und 3'-Hydroxylgruppen produziert. Sie benötigen im Allgemeinen Magnesiumionen (Mgzwei+), aber es gibt einige, die viel spezifischere Anforderungen haben.
Strukturell können sie als Monomere, Dimere oder sogar Tetramere auftreten. Die rekombinante Technologie verwendet Endonukleasen vom Typ II und aus diesem Grund wurden mehr als 3.500 Enzyme charakterisiert.
Diese Enzymsysteme bestehen aus zwei Genen, die als bezeichnet werden mod Y. Rindfleisch, dieser Code für die Untereinheiten, die DNA erkennen, und für Modifikationen oder Einschränkungen. Beide Unterstädte sind für die Restriktion notwendig, ein Prozess, der vollständig von der ATP-Hydrolyse abhängt..
Um das DNA-Molekül zu spalten, muss das Enzym mit zwei Kopien der nicht-palindromischen Erkennungssequenz interagieren und die Stellen müssen in umgekehrter Ausrichtung auf dem Substrat sein. Der Spaltung geht eine DNA-Translokation voraus.
Eine weitere Gruppe wurde kürzlich identifiziert. Das System besteht aus zwei oder mehr Genen, die für Proteine kodieren, die nur modifizierte DNA-Sequenzen spalten, entweder methyliertes, hydroxymethyliertes oder hydromethyliertes Glucosyl.
Beispielsweise erkennt das Enzym EckKMcrBC zwei Dinukleotide der allgemeinen Form RmC; ein Purin, gefolgt von einem methylierten Cytosin, das durch mehrere Basenpaare getrennt werden kann - von 40 bis fast 3000. Die Spaltung erfolgt etwa 30 Basenpaare hinter der Stelle, die das Enzym erkennt.
Endonukleasen dieses Typs sind auch als Endonukleasen bekannt.Homing”. Diese Enzyme erkennen und schneiden die Ziel-DNA-Sequenz an einzigartigen Stellen im Genom von 14 bis 40 bp.
Diese Enzyme werden häufig in Introns codiert, und es wird angenommen, dass ihre Funktion darin besteht, den horizontalen Transfer der Schnittsequenzen zu fördern. Nach dem Schneiden erfolgt eine Abbau-Reparatur in der DNA-Doppelhelix basierend auf der komplementären Sequenz.
Endonuklease I von E coli Es wirkt als Abwehrsystem gegen Phagen und Parasiten. Es befindet sich hauptsächlich zwischen der zytoplasmatischen Membran und der Zellwand. Erzeugt doppelsträngige Brüche in der Fremd-DNA, mit der sie im periplasmatischen Raum interagiert.
CRISPR-Cas-Endonukleasen sind Enzyme, die auf den Abwehrmechanismus vieler Arten von Bakterien einwirken. Diese identifizieren und schneiden spezifische DNA-Sequenzen von eindringenden Organismen, bei denen es sich im Allgemeinen um Viren handelt.
Kürzlich entdeckten Forscher des Massachusetts Institute of Technology (MIT) das Genom-Editiersystem CRISPR-Cas12bm mit hoher Präzision für die Modifikation menschlicher Zellen.
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