Das DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) Es ist ein Farbstoff, der aufgrund seiner fluoreszierenden Eigenschaft als Marker dient und unter anderem in der Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrietechnik weit verbreitet ist. Die von ihm emittierte Fluoreszenz ist hellblau, ihre Anregung erfolgt zwischen 455-461 nm (UV-Licht).
DAPI-Farbstoff kann mit Leichtigkeit durch die Zellmembran toter Zellen gelangen. Es kann auch die Kerne lebender Zellen färben, aber in diesem Fall muss die Konzentration höher sein.
Der Farbstoff ist in der Lage, auf zelluläre DNA zuzugreifen, für die er eine besondere Affinität aufweist, und bindet mit großer Begierde an die stickstoffhaltigen Basen Adenin und Thymin. Aus diesem Grund ist es in einigen molekularbiologischen Techniken sehr nützlich..
Diese Verbindung gehört zur Gruppe der Indolfarbstoffe und hat nachweislich eine größere Empfindlichkeit gegenüber DNA als Ethidiumbromid und Propidiumiodid, insbesondere auf Agarosegelen..
Die Verwendung dieses fluoreszierenden Farbstoffs ist sehr breit, da er nützlich ist für: die Untersuchung von DNA-Veränderungen in apoptotischen Prozessen (Zelltod) und damit den Nachweis von Zellen in diesem Prozess; für DNA-Foto-Footprinting (DNA-Foto-Druck); bakterielle Kontamination zu untersuchen; oder um die nukleare Segmentierung zu visualisieren.
Es wurde auch bei der Untersuchung von Chromosomenbanden, beim Nachweis von DNA aus verwendet Mycoplasmas sp, bei der DNA-Protein-Wechselwirkung, bei der Färbung und Zählung von Zellen durch Immunfluoreszenz und sogar zur Färbung reifer Pollenkörner.
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DAPI ist die Abkürzung für seinen chemischen Namen (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol). Seine Summenformel lautet C.16H.fünfzehnN.5. Es hat ein Molekulargewicht von 350,3. In der Nähe des UV-Lichtbereichs (345 bis 358 nm) tritt die maximale Anregung des DAPI-DNA-Komplexes auf, während die maximale Fluoreszenzemission zwischen 455 und 461 nm auftritt..
Dieser Farbstoff ist dadurch gekennzeichnet, dass er ein gelbes Pulver ist, aber die mit diesem Fluorophor markierten Strukturen emittieren ein hellblaues Licht..
Es ist eine wasserlösliche Verbindung. Um jedoch ihre Auflösung zu beschleunigen, kann etwas Wärme angewendet werden. Es kann mit PBS verdünnt, aber nicht direkt darin gelöst werden..
Sobald der Farbstoff hergestellt ist, muss er im Dunkeln, dh lichtgeschützt, bei einer Temperatur von 2 bis 8 ° C (Kühlschrank) gelagert werden. Unter diesen Bedingungen ist der Farbstoff länger als 3 Wochen oder Monate stabil..
Wenn es vor Licht geschützt ist, aber bei Raumtemperatur belassen wird, sinkt seine Stabilität auf 2 oder 3 Wochen, aber wenn es direktem Licht ausgesetzt wird, ist die Verschlechterung sehr schnell. Wenn Sie viel länger lagern möchten, können Sie es bei -20 ° C in Aliquots verteilen.
Diese Färbung basiert auf der Erzeugung einer nuklearen Gegenfärbung in den wichtigsten molekularbiologischen Techniken, wie z. B.: Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie und Färbung von Metaphasenchromosomen oder Interphasenkernen..
Diese Technik basiert auf der großen Affinität des Farbstoffs zu den stickstoffhaltigen Basen (Adenin und Thymin), die im genetischen Material (DNA) in der kleinen Furche enthalten sind. Auf zytoplasmatischer Ebene hinterlässt es nur sehr wenig Hintergrund.
Wenn der fluoreszierende Farbstoff an die Adenin- und Thyminregionen der DNA bindet, steigt die Fluoreszenz signifikant an (20-mal mehr). Die Farbe, die es ausstrahlt, ist hellblau. Bemerkenswerterweise gibt es keine Fluoreszenzemission bei der Bindung an GC-Basenpaare (Guanin-Cytosin).
Es ist wichtig zu beachten, dass dies zwar auch eine Affinität zu RNA aufweist, dies jedoch kein Problem darstellt, da der höchste Grad an Energieemission von diesem Molekül bei einer anderen Wellenlänge (500 nm) auftritt, im Gegensatz zu DNA, die dies bei 460 nm tut . Zusätzlich beträgt der Anstieg der Fluoreszenz, sobald er an die RNA gebunden ist, nur 20%..
DAPI wird mehr verwendet, um tote (fixierte) Zellen als lebende Zellen zu färben, da eine viel höhere Konzentration des Farbstoffs benötigt wird, um letztere zu färben. Dies liegt daran, dass die Zellmembran für DAPI zu Lebzeiten viel weniger durchlässig ist.
DAPI-Färbung kann in Kombination mit roten und grünen Fluorophoren für ein mehrfarbiges Erlebnis verwendet werden.
DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) ist ein ausgezeichnetes Fluorophor und wird daher häufig in verschiedenen Techniken und für verschiedene Zwecke verwendet. Die Verwendung von DAPI in den Haupttechniken wird nachstehend erläutert.
Die Forscher Gohde, Schumann und Zante waren 1978 die ersten, die DAPI als Fluorophor in der Durchflusszytometrietechnik verwendeten und vorschlugen. Sie waren aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber DNA und ihrer hohen Intensität bei der Fluoreszenzemission sehr erfolgreich..
Die Verwendung von DAPI in dieser Technik ermöglicht die Untersuchung des Zellzyklus, die Quantifizierung von Zellen und die Färbung lebender und toter Zellen..
Obwohl es andere Farbstoffe wie Ethidiumbromid, Hoechst-Oxid, Acridinorange und Propidiumiodid gibt, ist DAPI eines der am häufigsten verwendeten, da es photostabiler ist als die zuvor genannten..
Für diese Technik ist es erforderlich, die Zellen zu fixieren, hierfür kann absolutes Ethanol oder 4% Paraformaldehyd verwendet werden. Die Probe wird zentrifugiert und der Überstand verworfen, anschließend werden die Zellen durch Zugabe von 5 ml PBS-Puffer für 15 Minuten hydratisiert..
Während der verstrichenen Zeit wird die DAPI-Färbung mit einem Färbepuffer (FOXP3 von BioLegend) in einer Konzentration von 3 uM hergestellt.
Die Probe zentrifugieren, den Überstand verwerfen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 ml DAPI-Lösung abdecken..
Nehmen Sie die Probe mit dem entsprechenden Laser zum Durchflusszytometer.
Eine andere Technik, bei der DAPI verwendet wird, ist die Durchflussmikrofluorometrie zusammen mit einem anderen Fluorophor namens Mithramycin. Beide sind nützlich für die individuelle Quantifizierung von Chloroplasten-DNA, aber DAPI eignet sich am besten zur Messung von T4-Bakteriophagenpartikeln..
Diese Technik verwendet grundsätzlich DNA-Sonden, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert sind, der DAPI sein kann..
Die Probe muss wärmebehandelt werden, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren und in zwei einzelsträngige Stränge umzuwandeln. Anschließend wird es mit einer denaturierten DNA-Sonde hybridisiert, die mit DAPI markiert ist und eine interessierende Sequenz aufweist..
Später wird es gewaschen, um zu eliminieren, was nicht hybridisiert hat. Ein Kontrast wird verwendet, um die DNA sichtbar zu machen. Das Fluoreszenzmikroskop ermöglicht die Beobachtung der hybridisierten Sonde.
Diese Technik hat den Zweck, bestimmte Sequenzen in der chromosomalen DNA nachzuweisen und die Diagnose bestimmter Krankheiten zu ermöglichen.
Diese zytomolekularen Techniken waren eine große Hilfe bei der Bestimmung von Details bei der Untersuchung von Karyotypen. Zum Beispiel hat es die Regionen gezeigt, die reich an Adenosin und Thymin-Basenpaaren sind, die als heterochromatische Regionen oder DAPI-Banden bezeichnet werden..
Diese Technik wird häufig zur Untersuchung von Chromosomen und Chromatin bei Pflanzen und Tieren sowie zur Diagnose pränataler und hämatologischer Pathologien beim Menschen eingesetzt..
Bei dieser Technik beträgt die empfohlene DAPI-Konzentration 150 ng / ml für eine Zeit von 15 Minuten..
Zusammengebaute Objektträger sollten lichtgeschützt bei 2-8 ° C gelagert werden.
Die Zellen werden mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Wenn andere Färbungen verwendet werden sollen, wird DAPI am Ende als Gegenfärbung belassen und die Zellen werden 15 Minuten lang mit PBS-Lösung bedeckt. Während die Zeit vergeht, bereiten Sie die DAPI-Lösung durch Verdünnen mit PBS vor, so dass die Endkonzentration 300 uM beträgt.
Dann wird das überschüssige PBS entfernt und 5 Minuten mit DAPI bedeckt. Es wird mehrmals gewaschen. Der Objektträger wird in einem Fluoreszenzmikroskop unter dem entsprechenden Filter beobachtet.
Diese Verbindung muss mit Vorsicht behandelt werden, da es sich um eine Verbindung mit mutagenen Eigenschaften handelt. Aktivkohle wird verwendet, um diese Verbindung aus wässrigen Lösungen zu entfernen, die verworfen werden sollen..
Handschuhe, Robe und Schutzbrille müssen verwendet werden, um Unfälle mit diesem Reagenz zu vermeiden. Bei Kontakt mit Haut oder Schleimhaut sollte der Bereich mit ausreichend Wasser gewaschen werden.
Sie sollten dieses Reagenz niemals mit dem Mund pipettieren, sondern Pipetten verwenden.
Kontaminieren Sie das Reagenz nicht mit mikrobiellen Mitteln, da dies zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann.
Verdünnen Sie die DAPI-Färbung nicht mehr als empfohlen, da dies die Qualität der Färbung erheblich beeinträchtigt..
Setzen Sie das Reagenz keinem direkten Licht aus und halten Sie es nicht warm, da dies die Fluoreszenz verringert.
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